综述丨ANNU REV FOOD SCI T: 下一代食品研究: 使用元组学方法表征食物链中的微生物群落
导读微生物存在于食物链中，并以积极和消极的方式影响食品的质量和安全。识别和理解这些微生物群落的行为有助于在公共卫生和食品行业环境中实施预防或纠正措施。目前依赖于培养的微生物分析非常耗时，并且只针对特定的微生物亚群。然而，更多地使用无需培养的元组学方法有可能促进对食物链中微生物群落的全面表征。事实上，这些方法在促进疫情调查、确保食品真实性、评估抗菌素耐药性的传播、追踪发酵和加工过程中的微生物动态以及揭示食物链中影响食品质量和安全的因素方面显示出潜力。本综述探讨了基于群落的方法，特别是基于测序的元组学方法的应用，以表征食物链中的微生物群落。
从农场到餐桌的食物链中的微生物影响着食品的质量和安全。历史上，基于培养的技术已被广泛用于表征这些微生物。然而，随着分子技术和高通量测序技术的发展，非培养技术越来越多地应用于食品微生物组分析。这导致了相应的从对食品微生物的特定分类群或种群的调查转向更广泛的基于群落的分析。这些方法基于核酸、蛋白质和/或代谢物的提取，无需培养即可检测和表征环境中的微生物。由于微生物的发生和相互作用会影响食品的质量和安全，因此对这些过程的深入了解有助于对不良食品安全事件进行早期干预，确保最佳食品质量，并确定理想或不理想微生物的来源。 尽管培养方法费时费力，但仍是食品工业中最常用的方法。但最大的限制之一是，这些方法往往只能检测样本中存在的一小部分微生物，因为它们依赖于单个微生物在培养基上的分离和生长，其代谢和生理需求可以在体外复制。这不仅忽略了部分可存活但不可培养的微生物(VBNC)，而且也没有考虑样本中存在的细菌群落之间的关系。据估计，在许多环境中，未培养的微生物占微生物总数的99%，这意味着使用传统培养方严重低估微生物数量。尽管这种程度的低估在食品系统中可能不那么严重，但是，由于食品和食品加工环境的微生物群落由复杂、动态的微生物群落组成，元组学方法有可能提供对这些群落更准确和更深入的理解。 本文简要介绍了微生物对食品质量安全的贡献以及微生物鉴定的传统方法。本综述的主要重点是基于测序的元组学方法及其对理解食品、食品相关环境和食品加工微生物群落动态的贡献，还简要提到了其他非测序的元组学方法。
食品质量往往与pH值和水分含量等物理参数有关，这些参数可影响食品和食物链中微生物的生长和生存。食品变质是使产品不受欢迎或不能被消费的过程或变化，它受到食品内在特性和外在环境的影响。这是一个复杂的过程，食物发生生化变化，通常是由于生态决定因素的微生物活动。常见的菌包括假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、希瓦氏菌属(Shewanella spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、乳酸菌(LAB)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。最终，不同的细菌会导致不同种类的食物出现不同的质量问题，如表1所示。此外，尽管酵母和霉菌的生长速度较慢，但它们能够利用食物系统中的许多生态位，并能够利用细菌无法利用的底物并耐受极端条件。常见的酵母菌包括接合酵母菌(Zygosaccharomyces，在高糖食品中)、酿酒酵母(Saccharomyces，导致葡萄酒产生气体和浑浊)和念珠菌(Candida，导致肉类和奶制品异味)，常见的霉菌包括Zygomycetes(在高水分产品中)、青霉菌(Penicilliumspp.，导致水果腐烂)、曲霉(Aspergillus，谷物、香料和坚果中)。微生物也可以通过改变食物的内在特性来改善食品质量。这在发酵食品中是很明显的，微生物的活性除了延长保质期外，还可以提高其感官和营养品质。发酵食品微生物可以自发引入(从原料或生产或加工环境)或作为发酵剂接种，随着时间的推移，可以产生酶、挥发性化合物和抗菌分子，如有机酸、脂肪酸、过氧化氢、双乙酰和细菌素，有助于减缓或防止和病原微生物的生长。尽管微生物的自发引入与本综述有特定的相关性，但我们在此简要概述了发酵食品中一些最重要的微生物。
乳酸菌(LAB)是一些发酵食品生产中最重要的微生物之一。这反映在许多LAB对发酵食品环境的自然适应上，但多年来的研究已经对其进行了补充，以更好地理解和提高其对产品安全、感官、营养和健康特性的贡献。不同种类的LAB已被用于乳制品(奶酪和发酵牛奶)、肉类(香肠)、鱼、蔬菜(酸菜和泡菜)、酱油、谷物(酵母)和酒精饮料(葡萄酒)。另一类与发酵有关的细菌是醋酸菌，主要由醋酸杆菌(Acetobacter)和葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter)组成。这类细菌在咖啡、可可和醋发酵过程中起着重要作用，因为它们具有氧化碳底物的能力。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对大豆的工业化发酵很重要，因为它们生长迅速，发酵时间短。酵母在许多发酵食品的生产中也起着重要的作用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)用于酒精发酵，酵母最终被用于许多本土发酵食品，因为它们耐酸，能够在高温下生长，并存在于多种环境中。在亚洲，人们普遍食用用酵母发酵的本土食物，如味噌、酱油和葡萄酒。
虽然发酵食品和其他微生物对食品质量和安全有贡献，但在食品安全方面，微生物往往被视为负面的，食源性病原体是每年全球食源性疾病和暴发的原因。据估计，欧洲每年因食用受污染食品造成4500人死亡(WHO 2017年)。2019年欧洲食源性疾病暴发的病原体是细菌病原体(26.4%)、细菌毒素(19.3%)、病毒(10.7%)以及寄生虫和其他病原体(3.6%)，40%的疫情报告有未知病原体(EFSA & ECDC 2019)。常见病原菌有蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Listeria monocytogenes、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、金葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、弧菌(Vibrio spp.)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)等。诺如病毒和戊型肝炎等病毒以及寄生虫(包括刚地弓形虫Toxoplasma gondii和旋毛虫Trichinella spiralis)，也是疾病暴发的常见原因。病原微生物进入食物链的途径多种多样，可以是原料本身所固有的，也可以通过设备、食品加工机或包装材料等途径在加工过程中引入。微生物群落也可以以生物膜的形式存在，它们是附着在固体表面的微生物群落，可能含有可以在食品加工设施表面持续存在的致病和物种。这些生物膜一旦附着，就很难去除，因为它们嵌入聚合物基质中，而且生物膜中的细胞可能对消毒剂或抗菌剂具有抗性，特别是在混合物种生物膜中。为了克服食品工业中的这一挑战，正在进行预防生物膜形成和去除现有生物膜的控制策略的研究工作。食品安全管理制度，包括危害分析和关键控制点，以及风险评估原则已得到广泛实施以预防食源性疾病和暴发，并控制病原体在食物链中的传播。然而，这些管理系统依赖于对存在的微生物及其可能构成的风险的全面了解。 尽管从食品安全的角度来看微生物往往是负面的，但有些微生物在生物控制或生物保存方面很有用。微生物拮抗作用已通过细菌素、噬菌体等应用于食品工业。细菌素是一种由抗菌肽组成的物质，已被用于靶向食品中的菌和致病菌，从而延长食品的保质期并提高食品的安全性。来自LAB的细菌素(如乳酸链球菌肽)已被批准用于食品，最常用于肉类、奶制品和蔬菜产品。细菌噬菌体或噬菌体是细菌的病毒捕食者，已显示出巨大的前景，因为它们是自然产生的，并控制特定的病原菌，而不影响食品的质量和微生物群。噬菌体已被应用于从农场到餐桌各个阶段的一系列食品中，以消除常见的病原菌，如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7等。此外，一些物种的生物膜可以通过战胜不良细菌来帮助提高食品安全。一些LAB菌株被发现对有害细菌表现出拮抗特性，充当天然屏障，并改变微生物的生物膜形成。在食品中，微生物群落及其相互作用对食品质量和安全起着至关重要的作用。
如上所述，基于培养的测定方法历来被用于检测、计数和分离食品和环境样品中的活的食源性病原体或微生物。一般来说，样品首先要均质化，然后通常要进行富集步骤(预富集和选择性富集)，然后是选择性或差异电镀以区分存在的其他微生物，最后通过生化、血清学或其他方法进行鉴定。预富集用于恢复受损细胞和稀释食物样品中的抑制性化合物，而选择性富集增加了目标病原体的浓度，同时抑制了其他微生物的生长。这些传统方法价格低廉，但耗时费力，根据目标微生物的不同，接种、分离和鉴定需要2-3天到一周的时间。此外，由于可能存在VBNC细菌，可能会出现假阴性，这可能意味着无法成功检测到食品中的病原体或菌。 由于需要更及时地检测细菌以应对食源性暴发，近年来已经深入研究了用更快的免疫学或基于分子的方法取代传统电镀步骤的快速方法，并得到了更广泛的采用。食品病原体的检测需要高水平的灵敏度和特异性。基于抗原与抗体特异性结合的免疫学方法，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，已经显示出了潜力，但它们缺乏灵敏度和相对较高的检测限[103-105菌落形成单位(CFUs)/mL]，这意味着通常需要在检测之前先进行富集。然而，当ELISA与纳米技术相结合时，其在食品分析中的应用获得了更高的灵敏度、特异性和稳定性。 与传统的培养方法相比，聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)等基于核酸的技术需要更短的时间，并且通过多路复用可以促进同时检测、实时监测和定量多个微生物目标。开发和优化每种检测方法非常重要，因为复杂的食物基质可能会阻碍核酸提取，并含有可能干扰检测反应的。尤其在多路复用时，引物设计至关重要，因为引物组需要相似的退火温度才能成功进行检测。不幸的是，这些方法(如基于免疫的检测)，由于其检测限(103-104CFUs/mL)，通常仍需要富集或浓缩步骤，而且由于病原体在食品中的浓度通常较低，因此很难直接检测。另一种主要用于临床环境的快速方法是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，它分析电离和飞行时间检测后来自核糖体蛋白的信号，这些信号对于每种菌株都是独特的，从而可以快速鉴定微生物。尽管这些快速方法通常优于基于培养的方法，但在常规采用之前，行业和监管机构需要进行彻底的验证。 尽管基于培养的方法和快速方法可用于识别复杂食品或食品环境相关样品中的微生物，但它们对特定微生物的重视程度不平衡，尽管进行了多路复用，但仍然仅捕获整个微生物群落的一小部分。由于微生物存在于群落中，因此对其进行研究非常重要，因为一个物种或菌株的生长、生存和活动可能会影响或与另一个物种或菌株的存在有关。此外，从实践角度来看，理论上可以同时鉴定食物链样本中所有病原体和微生物的方法可能会产生破坏性的积极影响。
技术的进步为更快和更好地表征食物链微生物组提供了机会，并转向用非培养的基于分子的方法取代或补充依赖于培养的方法。全基因组测序通过提供比以前的分型方法更深入的微生物菌株鉴别能力，成功地补充了依赖于培养的方法，美国和欧洲的监管机构现在将其作为病原体分型和抗菌素耐药性(AMR)监测的工具。在大肠杆菌O157:H7暴发调查中，基因组测序方法优于其他分型方。
