基因剖析技能简介 陶慧卿 在生物、医学、农牧业范畴的使用 测序的使用 ? 基因组DNA测序 ? ? ? cDNA测序 不知道序列测序 已知序列再测序 双脱氧链终止法的原理 Sanger双脱氧链终止法的最大特 点是引入了双脱氧核苷三磷酸 （2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。 ddNTP能够在DNA聚合酶的效果 下和多核苷酸链的3ˊ羟基构成磷酸 二酯键，但却不能再与下一个核苷酸 缩合，成果使得多核苷酸链的延伸终 止。 双脱氧链终止法测序的首要过程 扩增待测DNA片段，使其变性，取得单链DNA模板。 挑选一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放 射性同位素符号。 引物先同单链模板复性。 在四个反响管平分别参加待测DNA单链模板、互补 引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶) 以及不同的ddNTP进行聚合反响。 双脱氧链终止法测序与PCR的差异 ? 测序只用一条引物，PCR需求两条引物 ? 测序产品线性增加，PCR产品指数增加 ? 测序需求dNTP和ddNTP ，PCR只用dNTP ? 测序产品是一系列长度相差一个碱基的片段，PCR产品只要一条带 双脱氧链终止法的开展 1、商品化测序试剂盒 - 荧光染料符号 ABI PRISM BigDye v3.1和v1.1试剂盒 2、自动化测序仪 ABI PRISM 310、3100和3730全自动遗传剖析仪 BigDye v3.1试剂盒的反响系统及条件 反响系统： 单链DNA模板 引物 DNA聚合酶 Mg2+ 4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种不同的荧光符号的ddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 循环条件： 96℃ 1min →(96℃ 10s →50℃ 5s → 60℃ 4min)× 25个循环 → 4℃保温 ABI Prism 310 Genetic Analyzer capillary Syringe with polymer solution Injection electrode Outlet buffer + Autosampler tray Inlet buffer 电进样及电泳 Electrode Capillary Sample Vials Autosampler Tray See Technology section for more information on CE 荧光激起和检测 影响测序质量的要素 测序成功的条件：PCR自身是成功的 ? ? ? ? PCR产品一定要通过纯化后再测序 测序引物比PCR引物靠后一些(Nested primers) 在测序反响过程中反响体积不要有动摇（蒸腾） 挑选适宜的测序产品纯化办法 SNP筛查 单核苷酸多态(SNP)是基因组中最为丰厚的遗传多 态，是决议个体差异的最首要的遗传根底。 多态方式首要包含单碱基代替、刺进或缺失，一 般也包含细小片断刺进/缺失。 因为许多SNP位点自身便是功用多态位点，使得 SNP在疾病易感基因的相关性研讨中有着广泛的使用。 SNaPshot? Multiplex System SNaPshot 试剂盒的反响系统及条件 反响系统： 单链DNA模板 引物 DNA聚合酶 Mg2+ 循环条件： (96 ℃ 10 sec → 50 ℃ 5 sec → 60 ℃ 30 sec) × 25循环 → 4℃保温 4种不同的荧光符号的ddNTP 办法特色 分型精确：该技能也称小测序技能，其精确度仅亚于 直接测序。 ? ? 多位点一起检测：能够一起检测达12个位点，而 Taqman一次仅能检测一个。 ? 不受样本量的约束:而Taqman对少数样本不适合。 注意事项 ? 1． 同一反响管中，不同位点的引物长度有必要不同，最好能相差4-6个碱基。 2． 引物与模板互补部分（有用引物）的Tm值至少要50℃ 。 3． 为了改动引物的长度，区别不同的位点，能够在引物的5’端加poly(dT)、 poly(dA)、poly(dC)或许poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易构成二 级结构，而且都通过试验验证。当心：poly(dT)有可能与线’端的 poly(dA)尾巴互补。 4． 在引物规划的时分，假如+链DNA的序列不抱负，难以规划出最佳引物， 请使用-链DNA规划引物。 ? ? ? 微卫星多态(STR)剖析 微卫卫星多态位点是一种短核苷酸串连重复多态 （short tandom repeat, STR）,重复单元一般为25bp,因为这种重复序列在DNA仿制过程中不稳定，所以 骤变很高，然后导致这种符号位点的多态性很强，杂 合度很高，正因为这种特色，微卫星多态在遗传剖析 中有着广泛的使用. STR剖析试验原理及过程 荧光——引物 PCR 荧光——PCR产品 电泳 荧光激起与检测辨认记载 数据处理 成果 肿瘤和正常安排微卫星标志共同，为MSS 肿瘤和正常安排微卫星标志呈现缺失，为MSI-H
